細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

一、   程序凍存步驟（需梯度降溫）

1、 配置凍存液，凍存液推薦配比：55%（基礎(chǔ)培養(yǎng)基）+40%(血清)+5%（DMSO）或90%胎牛血清+10%DMSO；推薦使用Procell通用血清型程序凍存液，貨號PB180436；

2、 制備好的細(xì)胞懸液計數(shù)，計算總細(xì)胞量；

3、 細(xì)胞離心后盡量吸干凈上清，離心轉(zhuǎn)速1200rpm（250g）3min；

4、 加入配置好的凍存液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×10⁶~1×10⁷cells/mL；

5、 分裝入凍存管，一個凍存管分裝1~1.5毫升；

6、 推薦使用程序降溫盒，分裝好的凍存管轉(zhuǎn)入程序降溫盒后直接放入-80℃冰箱過夜；

7、 如沒有程序降溫盒，則按下列順序依次降溫：室溫→4℃ 20min→-20℃ 30min→-80℃過夜→液氮保存，注意轉(zhuǎn)移過程中要保冷，避免產(chǎn)生溫差或凍存管融化；

8、 從-80℃冰箱取出凍存管迅速轉(zhuǎn)移到液氮長期保存。

注意事項：

1、 DMSO配制的時候會放熱，一定要等凍存液冷卻后使用，避免灼傷細(xì)胞；

2、 細(xì)胞離心后盡量吸干凈上清液，減少培養(yǎng)基殘留，避免稀釋凍存液；

3、 不建議手動梯度降溫，溫度不穩(wěn)定，容易降低存活率；

4、 注意程序降溫盒內(nèi)異丙醇的量必須高于最-低刻度線；凍存5次后異丙醇需要更換一次，以免影響凍存效果；程序降溫盒需恢復(fù)到室溫以后才能繼續(xù)使用，不能從冰箱拿出來直接使用；

5、 細(xì)胞懸液加入凍存液以后盡量短時間的在常溫放置，DMSO常溫下對細(xì)胞損傷大，分裝完成后立即轉(zhuǎn)入程序降溫盒放到-80度冰箱，不需要放4度；

6、 -80度凍存過夜后可以轉(zhuǎn)入液氮長期保存，轉(zhuǎn)入液氮的過程需要對凍存盒進(jìn)行保冷，不要長時間在常溫暴露，避免凍存管融化；

7、 若沒有液氮罐，存放在-80度的時候一定要放靠里面的位置，避免開關(guān)冰箱導(dǎo)致溫度不穩(wěn)定。

8、 細(xì)胞凍存后應(yīng)取出一管復(fù)蘇，檢測細(xì)胞的存活率。理論上細(xì)胞可在液氮內(nèi)長期保存，為穩(wěn)妥起見可在細(xì)胞凍存半年后復(fù)蘇培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長情況，再繼續(xù)凍存；

二、   非程序凍存步驟（需使用無血清凍存液）

1、  凍存液叢冰箱提前拿出回溫到室溫，推薦Procell無血清非程序凍存液，貨號PB180438；

2、  制備好的細(xì)胞懸液計數(shù)，計算總細(xì)胞量；

3、  細(xì)胞離心后盡量吸干凈上清，離心轉(zhuǎn)速1200rpm（250g）3min；

4、  加入無血清非程序凍存液（PB180438）重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×10⁶~1×10⁷cells/mL；

5、  分裝入凍存管，一個凍存管分裝1~1.5毫升；

6、  分裝好的凍存管直接轉(zhuǎn)入-80度冰箱過夜，不需要程序降溫盒；

7、  轉(zhuǎn)入液氮途中需將凍存管做好保冷措施，避免直接暴露于常溫，快速轉(zhuǎn)入液氮罐進(jìn)行長期保存；

注意事項：

1、 由于沒有使用凍存盒，在轉(zhuǎn)入液氮的過程中一定要對凍存管做好保冷措施，不能直接用手拿，可以用干冰或者少量液氮保護(hù)后轉(zhuǎn)移，操作過程注意安全；

2、 轉(zhuǎn)移過程要快，避免凍存管暴露于常溫后融化；

3、 若沒有液氮罐，存放在-80度冰箱的時候一定要放靠里面的位置，避免開關(guān)冰箱導(dǎo)致溫度不穩(wěn)定；

三、   細(xì)胞復(fù)蘇步驟

1、  將水浴鍋預(yù)熱至37℃，準(zhǔn)備好干凈的一次性PE手套，一個無菌離心管內(nèi)加入9ml無菌培養(yǎng)基；

2、  將細(xì)胞從液氮罐中取出放入PE手套中，迅速沒入水浴鍋，搖晃凍存管加速溶解，以1分鐘內(nèi)全部溶解為宜；

3、  在超凈臺中將復(fù)蘇好的細(xì)胞液加入到裝有新鮮培養(yǎng)基的離心管內(nèi)，1200rpm/min 離心3分鐘，離心完畢去掉上清；

4、  用適量與細(xì)胞對映的*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接入到無菌容器中（培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿），補充培養(yǎng)基到適宜，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

注意事項：

1、 水浴鍋的位置如果與液氮罐不是一個房間，需要對凍存管進(jìn)行保冷后轉(zhuǎn)移到水浴鍋旁，避免路途細(xì)胞表面融化；

2、 細(xì)胞溶解過程快速搖晃以加速溶解；

3、 已溶解的凍存細(xì)胞盡量短時間的在常溫存放，盡快離心去除DMSO；

4、 貼壁細(xì)胞復(fù)蘇24小時后觀察，若密度達(dá)到80%，則正常傳代；若密度不到80%則繼續(xù)培養(yǎng)到48小時再換液；

5、 懸浮細(xì)胞復(fù)蘇3天內(nèi)不建議離心換液；

6、 對DMSO不敏感的細(xì)胞在復(fù)蘇時也可不離心，減少操作步驟，也可降低污染的幾率。將解凍的細(xì)胞懸液直接轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶內(nèi)，補加新鮮培養(yǎng)基，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。但培養(yǎng)12~24h后必須換新鮮的培養(yǎng)基，移除死細(xì)胞。