細胞培養(yǎng)中常見細胞污染類型及預防辦法

凡混入細胞培養(yǎng)環(huán)境中對細胞生存有害的成分和造成細胞不純的異物都應視為污染，細胞污染不能*被消除，但能減少其發(fā)生的頻率和后果的嚴重性。

本文將簡要介紹幾種常見的細胞污染類型及處理方法。

常見污染類型

細菌污染

特征：大小在0.5~5 μm，比動物細胞小很多。多呈球狀或桿狀，形態(tài)規(guī)則，分布均勻；增殖速度快，一般污染后48~72小時爆發(fā)式增殖；營養(yǎng)消耗快，培養(yǎng)基很快變黃，變渾濁；鏡下觀察有明顯的定向運動。

處理方法：輕度污染可用10X雙抗清洗處理，重度污染建議消殺后丟棄。

真菌污染

特征：呈鏈球狀或絲狀。常形成肉眼可見的菌落，培養(yǎng)基顏色無變化或變紫，僅對局部細胞影響較大，其他地方生長正常。會形成孢子，容易污染其他細胞。

處理方法：真菌污染較難根-除，不建議保留，建議消殺后丟棄。

支原體污染

特征：最小的微生物，無法通過光學顯微鏡看見，但可通過電鏡觀察到。感染支原體的細胞，在某一時間點碎片突然增多，隨著傳代，細胞狀態(tài)顯著變差。支原體污染可通過氣溶膠傳播，影響同一細胞房其他細胞。

鑒定方法：PCR法、顯色法、熒光染色法等。

處理方法：若細胞狀態(tài)尚可，添加支原體抑制劑培養(yǎng)2-3代可轉(zhuǎn)陰；若細胞狀態(tài)很差，建議消殺后丟棄。

黑膠蟲污染

特征：無明確定義，鏡下無法直接觀察到。主要表現(xiàn)為細胞狀態(tài)差，黑點和碎片多，布朗運動。通過檢測發(fā)現(xiàn)主要為支原體污染，部分為未知的增殖不明顯的微生物污染。

處理方式：若細胞狀態(tài)尚可，添加黑膠蟲/支原體抑制劑培養(yǎng)2-3代可轉(zhuǎn)陰；若細胞狀態(tài)很差，建議消殺后丟棄。

細胞交叉污染

特征：即不同的細胞混雜在一起

鑒定方法：

同種屬：STR鑒定，多等位基因數(shù)大于3個。
（需考慮本身的遺傳背景，如EA.hy 926為融合細胞，本身就包含兩套遺傳信息）

不同種屬：PCR法，對種屬特異性基因進行擴增，不同種屬產(chǎn)物大小不同。

處理方法：建議重新引種。

細胞污染后的處置

細胞一旦發(fā)現(xiàn)有污染出現(xiàn)，應及時對所用試劑和耗材進行清理。耗材可更換新的或者重新高壓滅菌，試劑可重新過濾除菌或者更換新批次，操作臺和細胞房需用消毒液進行全面清潔消殺后方可復蘇新的細胞，以免反復出現(xiàn)污染。

污染防治策略

1 細胞房環(huán)境控制

環(huán)境要求：

潔凈區(qū)10000級，局部100級，定期進行沉降菌檢測

環(huán)境消毒：每周一次定期消毒滅菌

1） 地面/墻面：84消毒液、新潔爾滅交叉使用

2） 環(huán)境消毒：定期紫外照射，臭氧熏蒸

3） 儀器設(shè)備表面：75%酒精擦拭

2 實驗人員管理

著裝：著連體衣，戴口罩、手套，頭發(fā)、手腕等要包好，減少皮膚外露。

行為：減少走動，出入關(guān)門，操作時不要講話。

技能：養(yǎng)成良好的無菌操作習慣。

其他：減少共用物品，公共使用區(qū)域統(tǒng)一使用習慣，區(qū)分潔凈區(qū)域和有風險的區(qū)域。

3 實驗用品管理

試劑：使用前確保無菌，自己配制的試劑需過濾除菌后再使用。

耗材：需要重復使用的耗材確保按照規(guī)定清洗、高溫高壓滅菌，使用滅菌指示帶。滅菌后烘干的耗材立刻放進超凈臺，一周內(nèi)使用完畢，未使用完的，需重新滅菌再使用。

儀器設(shè)備：定期擦拭消毒，培養(yǎng)箱、顯微鏡托盤等高風險區(qū)域需經(jīng)常清潔，培養(yǎng)箱水盤和復蘇用的水浴鍋需添加抑菌劑。

其他：當出現(xiàn)培養(yǎng)物泄漏時，應及時清理干凈；出現(xiàn)局部污染時，應找出污染源并對環(huán)境整體消毒。