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原代細胞具有貼壁特殊性，因此在消化后轉(zhuǎn)移至其他實驗器皿（如玻璃爬片、培養(yǎng)板、共聚焦培養(yǎng)皿等）時，常出現(xiàn)貼壁不牢的情況，因此我們需要對實驗器皿進行包被處理，以增強細胞的貼壁性。
本期細胞學堂將為您詳述原代細胞培養(yǎng)中的包被操作步驟及注意事項，讓您的實驗順暢無阻！
為了適應(yīng)不同實驗需求，需要對培養(yǎng)器皿用不同的物質(zhì)包被后使用，包被條件常選用膠原蛋白Ⅰ（12μg/mL）、多聚賴氨酸PLL（0.1mg/mL）和明膠（0.1%）三種，依據(jù)細胞種類而定。
NO、1
膠原蛋白Ⅰ
膠原蛋白Ⅰ是最常見的膠原蛋白，能促進細胞的貼壁和增殖，常用于上皮細胞、肝細胞、肌細胞等原代細胞的培養(yǎng)；
NO.2
多聚賴氨酸PLL
多聚賴氨酸是一種合成化合物，是帶正電荷的氨基酸，通過改變培育基質(zhì)外表的電極來促進細胞貼壁，其包被的培養(yǎng)板適用于神經(jīng)元細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞及轉(zhuǎn)染細胞系的培養(yǎng)；
NO.3
明膠
明膠來自于膠原的高分子量水溶蛋白混合物，0.1％的明膠溶液常用于包被培養(yǎng)器皿以促進細胞貼壁。明膠包被板常用于培養(yǎng)正常或轉(zhuǎn)染細胞如血管內(nèi)皮細胞、心肌細胞、胚胎干細胞、胰島細胞等。
1
準備器皿
取出無菌培養(yǎng)器皿，如T25培養(yǎng)瓶（以下以T25瓶為例）；
2
加包被試劑
取出包被試劑，在超凈工作臺內(nèi)用移液器吸取1-2mL，加入T25瓶內(nèi)，輕輕晃動瓶身，確保底部全部覆蓋液體（注：使用的包被試劑為膠原蛋白Ⅰ或明膠時，1瓶可一次性加入5mL，同時包被5瓶，用5mL潤洗每瓶瓶底部后，每瓶均分1mL進行后續(xù)包被操作)；
3
放入培養(yǎng)箱
將培養(yǎng)瓶蓋好，放入37℃培養(yǎng)箱。PLL包被需要靜置30-60min以上，膠原蛋白Ⅰ包被和明膠包被需要靜置1-2h以上；
4
吸取包被試劑
取出培養(yǎng)瓶，吸出多余包被試劑（可留取下次使用，建議PLL試劑重復(fù)使用不超過2-3次，膠原蛋白Ⅰ和明膠重復(fù)使用不超過1次，多次使用會增加污染概率，減弱包被效果）；
5
靜置
將培養(yǎng)瓶蓋好，放入37℃培養(yǎng)箱（也可放4℃冰箱，保持無菌即可），靜置4-24h以上，確保培養(yǎng)瓶底部干燥、無液體。包被完畢，培養(yǎng)瓶一般可存放3-7天（常溫或4℃），建議3天內(nèi)使用，存放過久，包被效果可能失效；
6
清洗
取出包被好的培養(yǎng)瓶，在超凈工作臺內(nèi)，用PBS或培養(yǎng)基清洗。PLL包被的培養(yǎng)瓶需清洗2-3次，膠原蛋白Ⅰ和明膠包被培養(yǎng)瓶則清洗1-2次即可；
7
包被完成
正常接種使用培養(yǎng)瓶。
01
包被試劑的保存：無菌多聚賴氨酸PLL（0.1mg/mL）需要4℃下保存，可保存三個月；無菌膠原蛋白Ⅰ（12μg/mL）和無菌明膠（0.1%）需要在4℃下保存，1-2周內(nèi)使用，蛋白制品放置過久易失效；
02
選擇包被液用量依據(jù)不同培養(yǎng)器皿而定，一般確保培養(yǎng)器皿底部完-全覆蓋為準（并且確保包被時間內(nèi)不干）；
培養(yǎng)器皿 | 用量推薦（僅供參考） |
12孔板/孔 | 0.5mL |
6孔板/孔 | 0.8mL |
6cm培養(yǎng)皿/皿 | 1-1.5mL |
10cm培養(yǎng)皿/皿 | 3mL |
T25瓶/瓶 | 1-1.5mL |
T75瓶/瓶 | 3-4mL |
03
PLL有輕微毒性，膠原蛋白Ⅰ、明膠配置溶劑部分有少量毒性，所以包被后的培養(yǎng)器皿，使用前必須用PBS或培養(yǎng)基清洗1-3次；
04
細胞爬片等玻璃制品因材質(zhì)問題，本身吸附能力弱，一般必須包被；
05
包被分為包被時間和干燥時間，包被時間是包被液吸附作用時間，一般按推薦時間即可。干燥時間是包被后培養(yǎng)器皿晾干時間，是為了確保包被液晾干，達到更好的粘性吸附效果；
06
以上所有操作均以無菌試劑、耗材，無菌環(huán)境內(nèi)操作為前提。
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