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神經干細胞（NSCs）因具備獨-特的增殖能力與多向分化潛能，在神經科學研究中發揮著重要作用。然而，在培養神經干細胞的過程中，科研人員常常會遇到培養要求高、分化控制難等挑戰。
那么，如何選擇合適的培養方式？不同培養條件對細胞狀態有何影響？本文將深入介紹和解析神經干細胞的培養方法、誘導分化策略，并為您解答常見實驗難題，助力您的研究更進一步！
神經干細胞的基本介紹
神經干細胞可以從不同的組織中分離獲得，常見的來源有胚胎、大腦皮層、海馬體和脊髓等。為了在體外成功培養神經干細胞，合適的培養體系至關重要，培養基的成分、添加劑的使用、培養條件等因素都對神經干細胞的增殖、存活以及分化狀態有著深遠的影響。
生長培養基
常用配方：DMEM/F12 + B-27（不含維生素A）+ bFGF + EGF + 雙抗
為更好地滿足神經干細胞的培養需求，普諾賽®提供經過配方優化的神經干細胞完-全培養基，助力您的神經干細胞培養工作更加高效、穩定。
培養條件
氣相：空氣，95%；CO2，5%
溫度：37℃
神經干細胞的培養方法
神經干細胞的培養方法主要分為懸浮培養和貼壁培養兩大類，這兩種方法各具特色，適用于不同的研究需求。
懸浮培養
通過使用未經TC（Tissue Culture）處理、未包被或低吸附的培養器皿和無血清培養基進行培養，自然形成神經干細胞球。
貼壁培養
通過將神經干細胞球消化分散成單個細胞后，接種在經TC處理和包被的培養器皿內，用無血清培養基進行培養，形成貼壁生長的單層細胞。
懸浮培養和貼壁培養優缺點
懸浮培養
優點 | 缺點 |
可以形成穩定的神經球，保持未分化狀態，有利于長期培養和大規模擴增 | 易形成大細胞球，中心細胞易缺氧、缺營養死亡 |
懸浮培養早期增殖速率優于貼壁培養 | 懸浮培養自噬體形成增多，可能因為神經球內細胞營養缺乏而激活自噬 |
培養條件和方法簡單，分離培養成功率高，離心或半量換液操作簡單 | 需要頻繁離心和重懸細胞，增加細胞損失 |
干性維持能力更強，相比貼壁培養不易分化 | 不利于誘導分化和分化形態觀察 |
貼壁培養
優點 | 缺點 |
能形成形態規則的單層細胞，傳代損耗低，容易觀察到細胞形態和分化階段，更有助于神經干細胞的培養和存儲 | 長期培養易自發分化 |
貼壁培養的單層NSCs，與培養基接觸面更大，誘導分化成功率更高 | |
貼壁培養的NSCs經多次傳代培養后仍可保持較強的增殖能力，同時具有多分化潛能的特性 | NSCs貼壁不牢，易脫落，需使用TC處理和包被的培養器皿；細胞傳代操作復雜，傳代后易再次懸浮成球 |
貼壁培養的NSCs自噬水平較低，有利于維持細胞的穩定性和增殖能力 |
神經干細胞的誘導分化
1）誘導分化為星形膠質細胞
將神經干細胞球體消化分散后離心，使用星形膠質細胞誘導培養基（DMEM高糖＋B-27，含維生素A＋N-2＋GlutaMAX＋FBS＋bFGF[1]）重懸細胞，鋪入多聚賴氨酸包被的培養瓶內培養。隨著誘導分化的進行，神經干細胞逐漸轉變為星形膠質細胞，其形態變化如圖1所示。
圖1. 神經干細胞誘導分化為星形膠質細胞的形態變化
2）誘導分化為少突膠質細胞
與星形膠質細胞誘導方法類似，使用少突膠質細胞誘導培養基（DMEM/F12＋B-27，含維生素A＋EGF＋bFGF＋T3＋胰島素[2]）誘導神經干細胞分化為少突膠質細胞，其形態變化如圖2所示。
圖2. 神經干細胞誘導分化為少突膠質細胞的形態變化
3）誘導分化為神經元細胞
將神經干細胞球體消化分散后離心，使用神經元細胞誘導培養基（Neurobasal神經元培養基+1% N-2+2% B-27含維生素A+NEAA+β巰基乙醇+L-谷氨酰胺）重懸細胞，鋪入多聚賴氨酸包被的培養瓶內培養。培養6天后，在神經元細胞誘導培養基中加入10 ng/mL GDNF和10 ng/mL BDNF，以進一步促進神經元的分化[3]。
神經干細胞培養常見問題解答
1）
如何準確判斷神經干細胞的傳代時機？
神經干細胞傳代時機需根據神經干細胞球的大小和形態判斷。應讓神經干細胞球中間保持明亮，避免細胞球生長過大。如圖3所示，右下角神經干細胞球體過大，球中部發暗，應該在這種狀態出現之前進行傳代。一般而言，神經干細胞進行1:2傳代后，大約2-3天可再次傳代。
圖3. 神經干細胞球生長形態
2）
神經干細胞較難消化成單個細胞，是否必須完-全消化？
在懸浮培養神經干細胞時，無需將神經干細胞球徹-底消化至單個細胞狀態。而貼壁培養神經干細胞時，需將其消化分散成單個細胞，這樣更利于細胞的貼壁生長（如圖4）。在此過程中，推薦使用Accutase酶，相較于常用的胰酶，Accutase酶消化作用更為溫和，能夠顯著降低對細胞的損傷風險。
圖4. 使用Accutase酶消化成單細胞接種圖
3）
懸浮培養神經干細胞，如何進行換液？
建議采用半量換液法進行操作，具體操作步驟如下：將培養瓶豎直靜置，待大部分細胞自然沉降后，吸棄原培養體積一半的細胞培養上清液，補加等體積新鮮培養基繼續培養。為減少細胞損失，可將培養上清轉移至離心管中，使用離心機500 rpm離心5 min后，棄去上清，用等體積新鮮培養基重懸細胞，放回原瓶繼續培養。
無論是懸浮培養還是貼壁培養，都各有優缺點，科研人員可根據實驗需求選擇合適的方法。此外，掌握正確的誘導分化策略和優化培養條件，能夠有效提升神經干細胞的培養成功率。
希望本篇指南能為您的實驗提供實用參考，如有更多疑問，歡迎留言交流！更多細胞培養干貨，請持續關注細胞學堂專欄~
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參考文獻
[1]
Sardar D, Lozzi B, Woo J, et al. Mapping Astrocyte Transcriptional Signatures in Response to Neuroactive Compounds[J]. International Journal of Molecular Sciences. 2021;22(8):3975.
[2]
楊慧敏. 新生大鼠神經干細胞定向分化為少突膠質細胞的實驗研究[D]. 重慶醫科大學, 2006.
[3]
李登賀. 神經干細胞定向分化為中間神經元的研究[D]. 昆明理工大學, 2016.
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